[화장품_효능 연구] Electron donating ability assay (DPPH radical scavenging ability assay)

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[서설]

화장품약리학과에 입학한 후 학부생 연구원으로 시작했을 당시 가장 처음 배웠던 실험이 EDA (DPPH) 실험이다.

이 실험에 대해 정리를 할 때면 항상 그 시절 처음 배웠던 기억이 나서 제대로 정리하고 싶은 생각이 든다.

당연한 소리겠지만 실험을 시작하기 전에 이 실험을 왜 하는지, 이 실험은 어떤 원리로 이루어져 있는지를 파악하고 나니 이해가 더 잘 되어 실험도 잘 되는 느낌이었다. 그럼 시작!

 

 

[실험 목적]

1. 물질의 항산화력을 측정하기 위함.

2. 천연물의 DPPH에 달린 Free radical의 환원력을 알아보기 위함.

 

 

[DPPH 시약의 구조]

 

DPPH 시약 구조

 

- DPPH는 화학적으로 안정화된 Free radical을 가지고 있는 수용성 물질

- 515-520nm에서 최대 흡광도를 가짐

- DPPH가 항산화 작용이 있는 물질과 반응을 하면, 전자를 내어주고 라디칼이 소멸되어 색깔이 변하게 되므로

(보라 → 노랑) 간접적으로 시료의 항산화 효능을 알 수 있다.

 

색 변화

구조 변화

 

 

[필요 시약]

1) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

- MW : 394.32 g/mol / 순도 : 98

- store at : 2-8℃ (냉동보관)

- solvent : 99% ethanol

2) Positive control

① BHA (Butylated hydroxyanisole)

- MW : 180.24 g/mol / 순도 : 98.5

- mp : 58-60℃ (실온 보관)

- solvent : 99% ethanol

② Ascorbic acid

- L-Ascorbic acid

- MW : 176.12 g/mol / 순도 : 98

- mp : 190-194℃ (실온 보관)

- solvent : water

 

 

[실험 준비]

1. DPPH - 10X 만들어서 냉동보관 후 희석해서 사용함. (Stock solution) (0.2mM이 되게 사용)

→ 어떤 논문에서는 0.4mM이 되게 사용, 랩실마다 다름

2. Dilute stock solutio: & 99% ethanol = 1:9 mixing

3. DPPH와 Positive control (본 연구실에서는 보통 BHA 사용) 은 호일로 차광

4. Dilution Rate (D.R, 희석배수) = 1.5

 

* D.R값 (Dilution Rate)

D.R 값의 이해

 

 

[실험 순서]

1. sample(타겟 시료)과 positive control를 농도별로 조제한다.

2. 96 well plate를 준비한다.

3. control 칸과 control blank 칸에 sample 용매와 positive control 용매를 100㎕ 씩 처치한다.

4. sample 칸 sample blank 칸에 농도별로 조제한 sample과 positive control을 100㎕ 씩 처치한다.

5. 조제한 0.2mM DPPH 용액을 control 칸과 sample 칸에 50㎕ 씩 처치한다.

6. DPPH 용액의 용매 99% ethanol을 control blank 칸과 sample blank 칸에 50㎕ 씩 처치한다.

7. 실온에서 차광하여 30분 반응 후 517nm에서 ELISA로 측정한다.

※ 거품 안 생기게 피펫팅 할 것.

 

농도 의존적으로 색이 변한 것을 확인하였다.

 

 

[보라색 → 노란색]

- 실험에서 사용되는 흡광도 파장 517nm에서는 보라색은 감지하고 노란색은 감지하지 못하여 흡광도 값을 얻는다.

- 효과가 뛰어난 시료에서는 작은 흡광도 값을, 효과가 떨어지는 시료에서는 큰 흡광도 값을 갖는다.

 

 

[흡광도 계산법]

흡광도 계산법