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[서설]
산화는 보통 ① 산소 원자가 붙는다, ② 수소 원자가 떨어진다, ③ 전자가 떨어진다, 라고 설명할 수 있지만, radical 소거능 실험의 '항산화'의 개념은 보통 radical을 불활성화 시켜서 산화 작용을 방지하는 개념이다.
ABTS assay는 DPPH (EDA) 실험 방법과 함께 항산화 활성 측정에 널리 사용되고 있다. 이 방법은 Lipophilic(친유성), Hydrophilic(친수성) 물질 모두 측정이 가능하다. ABTS는 DPPH와는 달리 수성과 유기용매에 용해가 된다.
[실험 목적]
1. 물질의 항산화력을 측정하기 위함.
2. Free radical을 소거해주는 능력을 나타내는 지표.
3. ABTS와 항산화 물질을 혼합했을 때 무색의 물질로 환원되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법임.
[ABTS 시약의 구조]
- 2,2-azino-bis (3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)와 Potassium Persulfate (과황화칼륨)과의 반응으로 ABTS+ radical 생성 -> 청록색 띰
- 시료를 첨가함에 따라 decolorization (탈색) 되는 것을 측정함
- Hydrogen-donating antioxidant와 Chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있음
[필요 시약]
1) 2,2-Azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid) (실온 보관)
2) Potassium Persulfate (실온 보관)
3) Positive Control
① BHA (Butylated hydroxyanisole)
- MW : 180.24 g/mol / 순도 : 98.5
- mp : 58-60℃ (실온 보관)
- solvent : 99% ethanol
② BHT (Butylated hydroxytoluene)
- MW : 220.35 g/mol
- mp : 70℃ (실온 보관)
- solvent : 99% ethanol
③ Ascorbic acid
- L-Ascorbic acid
- MW : 176.12 g/mol / 순도 : 98
- mp : 190-194℃ (실온 보관)
- solvent : water
[실험 준비]
1. ABTS 시약 제조 (Stock solution) (냉동보관)
① 7.4mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid) 계량, D.I.W에 용해시킴
② 2.6mM Potassium persulfate 계량, D.I.W에 용해시킴
③ 1번과 2번을 1:1로 Mixing (섞음)
④ 실온에서 차광한 상태로 24시간 반응 후 냉동보관 (24 hours reaction at shading, room temperature)
2. ABTS Stock solution을 D.I.W에 희석하였을 때, Control 부분의 흡광도 O.D값이 '0.706 ± 0.001' 되는 비율을 찾아 필요한 양만큼 희석한다.
3. ABTS 시약과 Positive control (본 연구실에서는 보통 BHA 사용) 은 호일로 차광
4. Dilution Rate (D.R 희석배수) = 2