[화장품_효능 연구] Superoxide Dismutase like activity assay (SOD 유사 활성 실험)

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[실험 목적]

1. 물질의 항산화력을 측정하기 위함.

2. Pyrogallol이 만들어내는 활성산소종을 없앨 수 있는 항산화 효소가 얼마나 있는지 측정하는 실험임.

 

 

 

Superoxide dismutase 원리

 

 → 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정함. (시료의 효능이 높을수록 pyrogallol 시약 색이 갈색으로 변하지 않음)

 

 

[필요 시약]

1) Trizma base

- MW : 121.14 g/mol / 순도 : 99.9

- store at : 실온보관

 

2) Hydrochloric acid (HCl)

- store at : 실온 보관

 

3) Pyrogallol (substrate)

- MW : 126.11 g/mol / 순도 : 98

- solvent : D.I.W

- store at : 실온 보관

 

4) Positive control

- Ascorbic acid (Vitamin C) in EtOH / D.I.W

- store at : 실온보관

 

 

[실험 준비]

1. 0.05M Tri-HCl buffer 제조

식 : { 몰 수(M) × 분자량 × (100/순도) ÷ 1000 (mL) } × (필요량) mL = (계량할 양) g

2. 1N-HCl을 이용하여 pH 8.5 맞춤

3. 7.2 mM pyrogallol in D.I.W

 

★ Buffer 넣는 이유 + pH 맞춰야 하는 이유

   ① 실험의 환경을 조성하기 위함

   ② 실험 반응을 최적화하기 위함

 

 

[실험 순서]

1. sample(타겟 시료)과 positive control를 농도별로 조제한다. (※ D.R 값 : 3)

2. 96 well plate를 준비한다.

3. control 칸과 control blank 칸에 sample 용매와 positive control 용매를 100㎕ 씩 처치한다.

4. sample 칸 sample blank 칸에 농도별로 조제한 sample과 positive control을 100㎕ 씩 처치한다.

5. 0.05M Tri-HCl buffer를 모든 칸에 100㎕ 씩 처치한다.

6. Pyrogallol 용매(D.I.W)를 control blank 칸과 sample blank 칸에 100㎕ 씩 처치한다.

7. Pyrogallol을 control 칸과 sample 칸에 100㎕ 씩 처치한다.

8. 실온에서 차광하여 10분 반응 후 420nm에서 ELISA로 측정한다.

※ 거품 안 생기게 피펫팅 할 것.

 

 

 

[Thesis search]

 

- Superoxide dismutase (SOD)는 체내에 유해한 superoxide anion radical과 반응하여 과산화수소를 생성하는 항산화 효소로 알려져 있음.

- 생성된 과산화수소는 다시 catalase에 의하여 무해한 물 분자와 산소 분자로 전환시켜 활성산소로부터 세포를 방해하게 되므로 인체를 보호하는데 없어서는 안 될 중요한 효소임.

- SOD는 분자량이 비교적 큰 단백질로 열이나 알칼리에 약하므로 이러한 단점을 보완할 수 있는 SOD 유사활성에 대한 연구가 진행되고 있음.

- SOD 유사활성은 활성산소종을 hydrogen peroxide (H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정함으로써 superoxide의 산화 억제 작용을 알아볼 수 있는 방법임.

 

출처 : 오희경 ( Hee-kyung Oh ). "정향 열수 및 에탄올 추출물의 항산화 및 항염 효과." 韓國食生活文化學會誌 31.5 (2016): 481-488. (Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Extracts from Eugenia caryophyllata Thunb)