[화장품 효능 연구] Cell subculture (세포 배양법) _ Adherent cell

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* 세포 배양(Cell subculture)은 비단 화장품 효능 연구 뿐만 아니라 세포를 다루는 모든 실험의 기본이다.
 
 

단층세포 배양법 (monolayer cell subculture)

 - 대부분의 부착세포(adherent cell)는 단층으로 부착하여 증식하므로 adherent cell subculture 법은 해당 배양법에 해당됨.
 - 세포 배양 조건 : 37℃, 5% CO2, 95% 공기의 조건이 갖춰진 배양기(incubator)에서 배양함.
 - cell의 상태를 매일 체크하여 Flask의 80% 이상이 찼을 경우 subculture를 진행하는 것을 권유함. (또는 stock 제조)
 - subculture 하기 전, media는 37℃ water bath에 warm 시킬 것.
 
 

  1. adherent cell subculture protocol _ Ex.) Raw 264.7 cell / B16F10 cell, Cell in T75 Flask

 
 1) Media의 색깔, cell density 확인 후 subculture를 시작함.
 
 2) Flask를 돌려 제일 안 쪽 모서리에 suction tip을 댄 후 suction을 시작함. 
 - Flask를 돌리는 이유는 cell에 tip의 끝이 닿지 않게 하고, media만 suction 하기 위함.

adherent cell subculture시, media suction

 
 3) Cell 떼어내기  
  B16F10 cell
   - Trypsin을 적정량 (T75 Flask -> 3mL / T175 Flask -> 5mL)을 처리한 뒤 3분 대기함.
   - Trypsin을 처리한 cell을 회수한 다음, new media로 washing 하여 flask에 부착되어 있는 cell을 모두 회수함. (현미경으로 관찰 요망.)
   - Trypsin을 처리하여도 cell이 떨어지지 않았다면 flask 옆면을 가볍게 두드려 분리되도록 함.

 or 

Raw 264.7 cell
   - suction 후 new media 10mL을 flask에 넣고 scraper로 긁어서 부착된 cell을 떼어냄. (긁은 뒤 현미경으로 관찰 요망.) _ Raw 264.7 cell
 

4) Flask 교체, 배양
   - 회수한 cell을 15mL conical tube에 넣고 원심분리를 함. (본인은 2000~3000 rpm, 1분 ~ 1분 30초로 진행하였음.)
   - 상층액과 침전물(cell의 pellet)을 확인 후 tube를 기울여 상층액을 suction함. 이 때, pellet에 suction tip이 닿지 않게, pellet이 빨려들어가지 않게 조심하여야 함.
   - new media 1 ~ 10mL을 넣고 충분히 pipetting mix (suspension) 하여 cell을 살살 풀어줌. 
   - 다시 원심분리와 상층액 suction을 함. (washing의 개념.)
   - new media 1mL을 넣고 충분히 pipetting mix (suspension) 하여 cell을 살살 풀어준 뒤, 9mL을 첨가함.
   - new flask에 new media를 먼저 넣은 뒤 suspension한 cell을 넣어줌.
   -  Labeling 함. _ 세포명, 날짜, subculture 횟수 (passage number), 세포에 따른 media 이름 (ex. DMEM, RPMI), counting 하여 배양했으면 어떤 양으로 cell을 접종했는지 (ex. 3x10^5) 또는 몇 대 몇으로 배양했는지 (ex. 1:3), 실험자 이름.
   - Incubator 에 보관함.