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세포 실험을 시작하기에 앞서 동결한 세포를 해동시켜야 한다.
해동시키는 작업은 간단하다.
[준비물]
1. 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin이 들어간 DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium) 배지
2. 15mL Conical tube
3. 전동 pipette
4. Mess pipette 10mL
5. Petri dish
6. 37℃ waterbath
7. 37% + 5% CO2 incubator
8. Cell
[순서 요약] _ 자세한 순서와 주의사항은 아래 사진과 첨부하였음.
세포 기준 - Raw 264.7 mouse macrophage Cell
1. 동결 보존된 바이알 (Stock vial)을 꺼낸다.
2. 37℃ waterbath에서 빠르게 녹여준다.
3. 15mL conical tube에 9mL 배지를 넣은 후 세포를 넣는다. (보통 1mL)
4. suspension 한 후 1분 동안 Centrifugation (원심분리) 한다.
5. Centrifugation 후 배지를 suction 하여 제거한다.
6. 배지를 제거한 conical tube에 새로운 배지 10mL을 넣은 후 suspension 하며 pellet을 풀어준다.
7. New bottle에 세포 현탁액을 넣은 후 배지를 접종한다.
8. bottle을 살살 흔들어서 세포가 골고루 퍼지게 한 뒤 배양한다.
[자세한 순서 + 주의사항]
세포 기준 - Raw 264.7 mouse macrophage Cell
1. 본 연구실에서는 보통 -80℃ 냉장고에 세포를 동결보존한다.
Cell thawing(세포 해동)은 동물세포배양을 시작하는 첫 단계로, 동결보존이 되어 있는 세포를 녹여서 생명활동을 다시 시작하는 단계이다.
※ 주의사항
- 액체 질소 탱크 혹은 deep freezer에 동결보존되어 있는 동물세포를 꺼낸 후에는 세포가 이미 상당한 손상을 받았기 때문에 실험을 신속하게 진행해야 한다. 세포 해동 시 충격을 많이 주면 동물 세포가 변형되거나 사멸할 수 있기 때문에 suspension 과정에서도 조심해야 한다.
2. 동결보존 중인 stock vial을 꺼낸다.
(본 연구실에서는 보통 stock vial에 1mL씩 소분을 해놓으므로, 원하는 동물세포의 vial 1개를 꺼내면 됨)
3. 37℃로 미리 예열해 둔 waterbath에서 빠르게 녹여준다.
4. DMEM 배지를 열기 전, 알코올램프에서 멸균해준다.
5. 15mL conical tube에 9mL 배지를 넣는다.
6. 1000㎕ 피펫 (micropipette)을 사용하여 vial 안에 있는 세포를 뺀다.
7. 9mL 배지를 넣은 conical tube에 넣어준다.
※ 주의사항
- 배지에 세포를 넣을 때 최대한 천천히 넣어주는 것이 좋다.
- 과격하게 pipetting을 하면 세포가 손상을 입을 수 있기 때문에 천천히 pipetting을 해준다.
8. suspension을 한 후 1분 동안 Centrifugation (원심분리) 한다.
9. Centrifugation 후 conical tube를 보면 세포가 가라앉은 것을 볼 수 있다. 이것을 pellet이라고 표현한다.
동물세포는 미생물보다 크기가 크고 무겁기 때문에 쉽게 침전이 되니 낮은 rpm에서 짧은 시간만 원심분리를 하여도 쉽게 pellet이 형성된다.
10. pellet을 건드리지 않고 조심스럽게 suction을 하여 배지를 제거한다.
11. 배지를 제거한 conical tube에 새로운 DMEM 배지 10mL을 넣은 후 suspension 하며 pellet을 풀어준다.
조심스럽게 suspension 하면서 pellet을 풀어주는데, 이때 동물세포가 단일세포로 풀어지도록 알맞게 suspension 하는 것이 중요하다.
12. New bottle에 세포 현탁액을 넣은 후 배지를 접종한다.
13. bottle을 살살 흔들어서 세포가 골고루 퍼지게 한 뒤 배양한다.
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