출처 : What Exactly is Collagen and Elastin? - Skin Perfect SpasSkin Perfect Spas
What Exactly is Collagen and Elastin? - Skin Perfect Spas
Collagen and elastin are protein-based fibers that are found within the skin. These fibers are primarily responsible for that youthful skin that we all long to have. Collagen is accountable for skin’s firmness and youthful texture; while elastin is respo
skinperfectspas.com
[실험 전]
Elastin은 진피 내 피부 탄력을 유지하며, collagen과 같이 그물망 구조를 형성하는데 Elastase는 이러한 Elastin을 분해하는 효소임.
[실험 목적]
1. 기질인 n-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide는 Elastase에 의해 활성이 되어 P-nitroaniline을 생성시키는 데, 생성된 P-nitroaniline에 대해 흡광도 405nm에서 측정하여 얼마만큼 있는지 확인하는 실험임.
2. Elastase가 저해된다면, P-nitroaniline 생성량이 적어 elastase에 대해 저해하는 효능을 알 수 있고, 이 결과를 통해 주름 개선에 얼마만큼 효능이 있는지 확인이 가능함.
[P-nitroanilide 발현 과정]
- 피부의 주름 생성은 주로 collagen과 elastin의 파괴 등에 의해서 일어남.
- collagen과 elastin과 같은 기질 단백질들의 합성을 촉진하거나, 이를 분해하는 효소의 활성을 억제함으로 주름 개선을 할 수 있음.
- 진피 내 피부 탄력을 유지하는데 중요한 elastase의 기질인 n-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide를 이용하여 p-nitroaniline (NA)가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여 측정하여 elastase의 활성을 확인함.
- sample과 control을 통해 주름 개선에 영향을 주는 elastin 분해 효소인 elastase 활성 억제를 보는 실험임.
[필요 시약]
1) Trizma base
- store at : 실온 보관
2) Substrate : n-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide
- store at : 냉장 보관
3) Enzyme : Elastase
- store at : 냉장 보관
4) Positive control
① Oleanolic acid
- store at : 실온 보관
- solvent : 99% ethanol
② Ursolic acid
- store at : 실온 보관
- solvent : 99% ethanol
③ Adenosine
- store at : 실온 보관
- solvent : D.I.W
[실험 준비]
1. 0.05M (50mM) Tris-HCl Buffer [pH 8.6] 조제
2. 0.4M Tris-HCl Buffer [pH 8.6] 조제
3. 0.6 units/mL Elastase in 0.05M Tris-HCl [pH 8.6] buffer
4. n-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide 0.1 mg/mL DMSO (dimethylsulfoxide) 와 0.05M Tris-HCl buffer 1:99로 희석.
ex) 60 mL 필요 → DMSO 0.6 mL에 녹인 후 0.05 M buffer 59.4 mL로 희석.
※ sample 색이 짙으면 결과값 주의. (OVER 값이 뜰 때가 있어, 이럴 경우 substrate 농도 낮출 것.)
5.water bath 또는 incubation 37 ℃로 미리 설정해 둘 것.
[실험 순서]
1. 96well 또는 Test tube를 준비한다.
2. sample과 positive control을 농도별로 조제한다.
3. control, control blank, sample, sample blank 칸에 0.4M Tris-HCl buffer를 50㎕씩 모두 처치한다.
4. control 칸과 control blank 칸에 sample 용매와 positive control 용매를 100㎕씩 처치한다.
5. sample 칸과 sample blank 칸에 농도별로 조제한 sample과 positive control을 100㎕씩 처치한다.
6. control, control blank, sample, sample blank 칸에 Elastase를 50㎕씩 모두 처치한다.
7. 37 ℃에서 30분간 반응한다.
8. n-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide의 용매인 0.05M Tris-HCl buffer를 control blank, sample blank 칸에 100㎕씩 처치한다.
9. n-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide를 control, sample 칸에 100㎕씩 처치한다.
10. 실온에서 차광하여 20분 반응 후 405nm에서 ELISA로 측정한다.
+) Question. Positive control로 ursolic acid를 사용하고 있는데, 활성이 -로 나올 경우 어떻게 해야 하는가?
Answer : 반응 온도를 25 ℃로 해보는 것을 추천한다.
[Thesis search]
- Elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 Elastin을 분해하는 효소이며, 체내의 elastin을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 그 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부 주름 및 탄력성 손실을 유발하기도 함.
- 또한, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비 특이적 가수분해 효소이기도 함. 따라서 elastase 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타냄.
→ Reference : 하고초 추출물의 생리활성.
- 인체의 중성구 과립구 내에 존재하는 elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 데 중요한 기질 단백질인 elastin을 분해하는 효소이며, Ursolic acid 등이 elastase 저해제로 이용되고 있음.
→ Reference : 캄보디안 상황버섯 추출물의 주름개선 효과 연구.
[Internet search]
① Ursollic acid
- elastase 저해제로 이용되고 있는데, 물이나 오일 등의 용매에는 잘 녹지 않는 물성을 가지고 있기 때문에 제제화하기 어려워 일반적으로 사용하기 어려운 문제점이 있음.
② Oleanolic acid
- 인체 생리활성 물질
- 식물계에 존재하는 대부분의 saponin이 이것임, 인삼에도 들어있음.
- 빛으로부터 피부 조직을 보호하는 내광성의 효능이 있음.
- 몰질량 : 456.7 g/mol