Celase® GMP, Collagenase/Neutral Protease Blend - Worthington Enzyme Manual
Celase® GMP, Collagenase/Neutral Protease Blend - Worthington Enzyme Manual
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[실험 전]
Collagen은 Elastin과 같이 진피 내 피부 탄력을 유지하며, 그물망 구조를 형성하는데 Collagenase는 이러한 Collagen을 분해하는 효소임.
즉, Collagenase는 Collagen에 있는 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소임.
[실험 목적]
1. Collagen을 분해하여 피부의 주름을 형성하는 Collagenase를 시료가 얼마나 저해할 수 있는 활성이 있는지 확인하는 실험임.
2. in vitro 상에서 collagen을 분해하는 collagenase 효소를 공시료액과 비교하여 collagenase 저해 정도를 확인하는 실험임.
[필요 시약]
1) Trizma base
- store at : 실온 보관
2) Calcium chloride
- store at : 실온 보관
3) Substrate : 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg trifluoroacetate salt
- store at : 냉동 보관
4) Enzyme : Collagenase (From clostridium histalyticum)
- store at : 냉동 보관
5) Citric acid
- store at : 실온 보관
6) Ethyl Acetate (EtOAC)
- store at : 실온 보관
7) Positive control
① EGCG (Epigallocatechin gallate)
- store at : 냉장 보관
- solvent : D.I.W
② Adenosine
- store at : 실온 보관
- solvent : D.I.W
[실험 준비]
1. 0.1 M Tris-HCl buffer pH 7.5 + 4mM CaCl2 조제.
- 0.1 M Tris-HCl [pH 7.5]
- 4 mM CaCl2 in 0.1 M Tris-HCl pH 7.5
2. 0.3 mg/mL 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg trifluoroacetate salt in buffer 조제.
3. 0.2 mg/mL collagenase in buffer 조제.
4. 6% citric acid in D.I.W 조제.
5. EtOAC 준비.
6. Voltex, Centrifuge 준비.
[실험 순서]
1. Test tube를 준비한다.
2. control과 control blank 칸에 sample 용매와 positive control 용매를 100㎕씩 처치한다.
3. sample 칸과 sample blank 칸에 농도별로 조제한 sample과 positive control을 100㎕씩 처치한다.
4. substrate를 control, control blank, sample, sample blank 칸에 250㎕씩 모두 처치한다.
5. control blank와 sample blank 칸에 collagenase 용매인 0.1 M Tris-HCl buffer pH 7.5 + 4mM CaCl2를 150㎕씩 처치한다.
6. control과 sample 칸에 collagenase를 150㎕씩 처치한다.
7. 실온에서 20분간 반응한다.
8. 6% citric acid를 control, control blank, sample, sample blank 칸에 500㎕씩 모두 처치한다.
9. Voltex를 한 뒤, EtOAC를 control, control blank, sample, sample blank 칸에 1,500㎕씩 모두 처치한다.
10. voltex를 20초 한 뒤, centrifuge를 10분, 3000 rpm으로 한 뒤 상층액을 320nm에서 UV spectrophotometer로 측정한다.
+) EtOAC는 pH 4.4, pH 5 이하에서는 효소 활성이 급격히 떨어지므로 collagenase의 활성을 저해함. 반응 정지 느낌.
정제 효소 35℃에서 최적 활성 보임. pH 5.5 ~ 11.5 사이 부근에서 안정성이 높음.
→ Reference : 재조합 Vibrio Parahaemolyticus 콜라겐 분해효소의 분리 및 특성 분석.
[Thesis search]
- 콜라겐은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조 중량의 약 70-80% 를 차지하고 있어, 세포외 기질의 대부분을 차지하면서 피부를 지지하는 역할을 함. 그러나 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소와 같은 내적 요인에 의해 콜라겐의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해가 가속화되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성됨.
→ Reference : 밤부산물(율피)의 주름개선 및 미백효과.
- Collagen은 피부에서 탄력과 결합에 중요한 역할을 하고 있는데 Trypsin과 같은 단백질 분해효소의 작용을 받지 않고 collagenase에 의해 분해됨. 따라서 collagenase는 세포외 기질 단백질을 분해하는 효소로 피부의 주름 생성을 촉진시키는 요인이 됨.
- 피부에서 세포외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성 성분인 collagen은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 단백질이며, 피부에 강도와 장력을 주며 진피의 90%를 차지하고 있음.
collagen의 주요 구성 단백질은 collagen type-Ⅰ이 대부분을 차지하며, collagen-type Ⅱ, fibronectin, integrin, fibrillin, proteoglycan 등이 존재함. 세포외 기질을 파괴하는 단백질 분해 효소는 serine 단백질 분해효소, cystein 단백질 분해 효소, Matrix metalloproteinase (MMP)로 나눌 수 있음.
→ Reference : 블랙초크베리 분획물로부터의 주름억제 효과에 대한 작용기전.
- Collagen은 피부, 건(tendom; 근육을 뼈에 부착시키는 중개역을 하고 있는 결합 조직인 섬유속. '힘줄'이라고도 함.), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는 데, 특히 뼈와 피부의 진피메 그 포함량이 높음.
- Collagen의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등이 알려져 있음. 이러한 collagen은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있음. 또한 collagen은 Trypsin 등의 단백질 분해 효소의 작용을 받지 않으나, collagenase에 의해 분해된다는 보고가 있음.
→ Reference : 헛개나무 추출물의 화장품 생리활성에 관한 연구.
- 피부는 크게 표피, 진피, 피하지방층으로 구성되어 있음. 자연노화와 광노화 모두 주름이 생성되고 피부 면역 세포인 랑게르한스 세포와 진피의 교원섬유가 감소한다는 공통점이 있으나, 자연 노화에서는 피부가 얇아지고, 광노화의 경우에는 탄력섬유의 변성이 심하여 collagenase 발현이 증가되어 있으므로, 피부가 두꺼워지고 변형된 탄력섬유가 증가하는 특징을 갖고 있음. 따라서 지금까지의 주름개선 연구는 collagen을 분해하는 collagenase, gelatin을 분해하는 gelatinase의 작용, 탄력섬유를 분해하는 elastase의 작용을 억제하는 물질개발에 중심이 되어 왔다.
→ Reference : 추출용매와 부위별 복령(Poria cocos)의 항산화, 항주름, 항염증 평가.