* Master hee 뚝딱뚝딱 화장품 채널 *
[서설]
꼼꼼히 읽어보면 이해할 수 있다. ^^
[실험 목적]
1. 시료의 요산 생성 효소인 Xanthine Oxidase의 저해 효과를 보는 실험임.
2. 반응액 중에 생성된 Uric acid를 흡광도 290(292)nm에서 측정함.
[Xanthine Oxidase 발현 과정]
- Xanthine Oxidase는 생체 내 Purine 대사에 관여하는 효소로써 Xanthine 또는 Hypoxanthine으로부터 요산(Urate, Uric acid)을 형성하며, Urate가 혈장 내에 증가되면 골절에 축적되어 심한 통증을 동반하는 통풍과 신장에 침착되어 신장 질환을 일으키는 효소로 알려져 있음.
- 통증을 일으키는 원인 물질인 요산은 Hypoxanthine과 Xanthine에서 Xanthine oxidase의 촉매로 산화되어 요산이 되며, 요산 생성 효소인 Xanthine oxidase는 MO와 Fe를 함유하는 Flavoprotein(플라빈단백질)임.
- 또한 Xanthine oxidase는 분자상의 산소를 수소 수용체로 이용하여 Xanthine을 Uric acid 형으로 산화하는 반응을 촉매함.
- Xanthine oxidase의 저해 효과는 유리 라디칼의 생성 억제와 더불어 생물학적으로 중요한 의의를 가진다고 할 수 있음.
∴ Xanthine oxidase : Hypoxanthine을 산화시켜 Xanthine을 만들고 이것을 다시 산화시켜 Uric acid로 하는 효소임. (각종 동물조직 · 우유 · 미생물 등에 존재, 간이나 우유 등에서 정제함. 최적 pH는 7.4로 중성임)
출처 : 김영훈,이수미,천순주,장민정,전동하,최향자,조우아,and 이진태. "4가지 한방 소재(행인, 호장근, 자초, 강황)의 항산화활성에 관한 연구." 한국패션뷰티학회지 5.4 (2007): 139-144.
[필요 시약]
1) KH2PO4 (Potassium phosphate monobasic)
- 제1인산칼륨
- MW : 136.09 g/mol
- store at : 실온 보관
- solvent : water
2) K2HPO4 (Potassium phosphate dibasic)
- 제2인산칼륨
- MW : 174.18 g/mol
- store at : 실온 보관
- solvent : water
3) Substrate
① Xanthine
- MW : 152.11 g/mol
- store at : 실온 보관
- physical state : 파우더상
4) Enzyme
② Xanthine oxidase
- MW : 270 g/mol
- store at : 2-8℃, 냉장 보관
- physical state : 파우더상
5) Positive control
① BHA (Butylated hydroxyanisole)
- MW : 180.24 g/mol
- solvent : 99% ethanol
[실험 준비]
1. 0.1M Potassium buffer [pH 7.5] 제조
* (2) 용액에 (1) 용액을 넣어 pH 7.5를 맞춘 후 사용할 것.
(1) 0.1M KH2PO4 (Potassium phosphate monobasic) in D.I.W
(2) 0.1M K2HPO4 (Potassium phosphate dibasic) in D.I.W
2. 2mM Xanthine in Buffer
- 플라스크에 넣고 호일로 차광 후 (바늘로 구멍 뽕뽕 뚫어서) 80-90℃ stirrer에 가열하면서 섞음.
(180℃로 가열하면 10분만에 녹음, 화상 주의할 것)
- 기질 먼저 계량 후 녹인 후 sample 계량할 것. → 식혀야 하기 때문
3. 0.049 units/㎖ Xanthine Oxidase in buffer
- 왜 0.049 units/㎖ 일까?
: 실험실마다 method가 다름. 찾아보고 만드는 논문에 따라 method를 만들었는데 본인 실험실은 0.049 units/㎖이었음.
- 단위는 어떻게 맞춰서 계산할까?
4. Water bath를 37℃로 미리 설정해둔다.
[실험 순서]
* D.R값 : 10
1. Test tube를 준비한다.
2. sample과 positive control을 농도별로 조제한다.
3. control 칸과 control blank 칸에 sample 용매와 positive control 용매를 100㎕씩 처치한다.
4. sample 칸과 sample blank 칸에 농도별로 조제한 sample과 positive control을 100㎕씩 처치한다.
5. 조제한 0.1M potassium buffer [pH 7.5]를 600㎕씩 모든 칸에 처치한다.
6. substrate(2mM xanthine in buffer)을 200㎕씩 모든 칸에 처치한다.
7. control blank 칸과 sample blank 칸에 Enzyme 용매(0.1M potassium buffer)를 100㎕씩 처치한다.
8. control 칸과 sample 칸에 Enzyme(0.049 units/㎖ xanthine oxidase)을 100㎕씩 처치한다.
9. 37℃로 설정해 둔 water bath에 15분 반응 후 정지시약인 1N HCl을 100㎕씩 모든 칸에 처치한 후 290nm에서 UV spectrophotometer로 측정한다.
* 거품 안 생기게 피펫팅 할 것.
그림 출처 : http://www.insung.net/web/goods/goods.view.php?encData=Z2lkeD0yMjQyJmNhdGVnb3J5PTAwMjAyOCZjYXRlZ29yeTI9JmNhdGVnb3J5Mz0mY29kZT0wMDIwMjg=