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[서설]
해당 실험 또한 H2O2 실험과 마찬가지로 간단한 실험이지만 손이 많이 가는 실험이라 시료가 많을 시 실험 스케줄을 넉넉하게 잡고 진행할 필요가 있다. 또한 96 well plate, Test tube만을 사용했던 실험과는 달리 ep tube와 96 well plate를 같이 사용한다.
[실험 목적]
1. 산화되어 생기는 손상으로부터 시료(샘플)가 얼마나 보호할 수 있는지 알아보는 실험.
2. 시료(샘플)의 환원력을 알아보는 실험.
→ Potassium Ferricyanide는 환원되어 Ferrocyanide로 변함. / 산화제인 Potassium Ferricyanide는 항산화능이 좋은 물질과 반응하면 환원됨.
[필요 시약]
1) NaH2PO4 (Sodium phosphate monobasic)
- MW : 119.98 g/mol
- store at : 실온 보관
2) Na2HPO4 (Sodium phosphate dibasic)
- MW : 141.96 g/mol
- store at : 실온 보관
3) K3Fe(CN)6 (Potassium Ferricyanide)
- MW : 329.24 g/mol
4) TCA (Trichloracetic acid)
- MW : 163.38 g/mol
5) Iron (Ⅲ) chloride (Ferric chloride)
- MW : 162.20 g/mol
6) Positive Control
- Ascorbic acid (Vitamin C) in EtOH / D.I.W
- store at : 실온보관
[실험 준비]
1. 0.2M Phosphate Buffer (pH 6.6) (buffer 제조 방법은 SOD assay에 기재함)
2. 1% Potassium Ferricyanide in buffer
3. 10% TCA in buffer
4. 0.1% Ferric chloride in D.I.W
* 상온에 잘 녹음
5. Heating기 50℃ 준비
[실험 순서] * 본 실험은 Control, Control Blank 칸이 없음
1. sample(타겟 시료)과 positive control를 농도별로 조제한다. (※ D.R 값 : 3)
2. ep tube를 준비한다.
3. 0.2M Phosphate buffer를 sample 칸, sample blank 칸에 각각 300㎕, 600㎕ 씩 처치한다.
4. 1% Potassium Ferricyanide를 sample 칸에 300㎕ 씩 처치한다.
5. 농도별로 조제한 sample을 sample 칸, sample blank 칸에 각각 300㎕ 씩 처치한다.
6. 50℃, 20min (Heating)
7. 10% TCA(Stop reaction 시약)을 sample 칸, sample blank 칸에 각각 300㎕ 씩 처치한다.
8. 12,000rpm, 10min 원심분리를 진행한다.
9. 새 ep tube를 준비한다.
10. 상층액을 500㎕ 를 따온다.
11. D.I.W를 500㎕ 를 처치한다.
12. 0.1% Ferric chloride 100㎕ 씩 처치한다.
13. Vortex 후 100㎕ 씩 96 well plate에 옮겨 700nm에서 ELISA로 측정한다.